Une Libellule au microtome

[Fredlab]

Hello

Voilà, puisque j'ai récupéré une libellule morte il y a peu, je me dis que je pourrais peut-être la préparer pour en faire des tranches.
Seulement, je suis un pur débutant en la matière.

Il y a à peu près un an, j'avais acheté quelques produits pour faire des coupes dans du végétal.
Je n'ai pas eu le temps (encore) de démarrer le projet.

J'ai du PEG 20000 - du PEG 4000 (et de la glycérine, au cas où)
J'ai aussi du "Roti-Histofix 10%"
Du "Roti-Mount Aqua"

Des lames "polysine"

Pour espérer faire des coupes transversales de la tête (ommatidies...), je commence par quoi ?

Merci pour votre coup de main.

PS : si la voie "aqueuse" ne vous parait pas appropriée, j'ai un gros flacon d'alcool isopropylique à 99,5%, je peux donc faire des solutions pour une déshydratation (combien de temps ?) - mais je n'ai aucun autre produit (j'avoue que je ne vois pas trop où me fournir s'il faut commencer à trouver du toluène ou d'autres produits du genre) ni paraffine...

[speculoos]

Hello

Voilà, puisque j'ai récupéré une libellule morte il y a peu, je me dis que je pourrais peut-être la préparer pour en faire des tranches.
....

J'ai du PEG 20000 - du PEG 4000 (et de la glycérine, au cas où)

le polyéthylène glycol c'est un ramollisseur , ca marche bien en cas de constipation grave !!!!
(et dans les e-mégots) !
la glycérine aussi !

En inclusion aqueuse il y a le PVA Alcool polyvinylique ( M. Lecomte en vend)

[KATZEN]

Bonsoir Frédéric,


vaste sujet que la préparation de tissus animaux pour leur inclusion et coupe au microtome ! belle entreprise quand on ne possède pas un robot d'inclusion..

ici une description sur le site Microscopies :

http://www.microscopies.com/DOSSIERS/PR ... RAF%20.htm
et ici :
http://histologie.euro-bioweb.eu.com/pa ... logie.html

J'ai essayé plusieurs fois la technique PEG de plusieurs densités sans résultat correct.

l'idéal reste la fixation puis les passage par des bains d'alcool de plus en plus concentrés jusqu'à l'absolu (99.5%- OK))

puis les bains dans le Roticlair ( 2 a 3 ) puis inclusion dans 3 bains de paraffine en étuve à 53-56 °..3X 12 h minimum pour l’Imprégnation des tissus.
Fabrication des blocs -retaille en faces parallèles , coupes au microtome type Minot,
étalement des coupes sur lames albuminées sur platine de Malassez -séchage.
Dissoudre la paraffine des lames avec deux bains de Roticlair et passages aux alcools jusqu’à la réhydratation et coloration - hématoxyline -eosine voire safran de Masson.ou autre .
Re- déshydratation ; éclaircissement et montage dans milieu transparent genre Roti-Mount ou Baume du Canada... OUF !!

Tiens nous au courant de tes résultats et montre nous tes toujours excellentes photos.

Bon courage .

[BINO-BONI]

Bonsoir Frédéric,


J'ai essayé plusieurs fois la technique PEG de plusieurs densités sans résultat correct.

l'idéal reste la fixation puis les passage par des bains d'alcool de plus en plus concentrés jusqu'à l'absolu (99.5%- OK))

puis les bains dans le Roticlair ( 2 a 3 ) puis inclusion dans 3 bains de paraffine en étuve à 53-56 °..3X 12 h minimum pour l’Imprégnation des tissus.
Fabrication des blocs -retaille en faces parallèles , coupes au microtome type Minot,
étalement des coupes sur lames albuminées sur platine de Malassez -séchage.
Dissoudre la paraffine des lames avec deux bains de Roticlair et passages aux alcools jusqu’à la réhydratation et coloration - hématoxyline -eosine voire safran de Masson.ou autre .
Re- déshydratation ; éclaircissement et montage dans milieu transparent genre Roti-Mount ou Baume du Canada... OUF !!
Bon courage .

Quelle galère !

Pas de méthode plus simple pour débuter? On a innové des tas de solutions pour aller sur la lune il y a 50 ans et on continue à préparer des inclusions comme au début du XX ième siècle?

[KATZEN]

Hello,


ce ne sont pas les mêmes budgets !!!

[speculoos]

J'ai essayé plusieurs fois la technique PEG de plusieurs densités sans résultat correct.

Bonjour Gérard
tu peux me donner la procédure au PEG
là, j'ai une mouche qui barbote dans du PEG 400 depuis 2 jours, au frigo, je vois pas la finalité, ou alors je la colle au congélo ?

je veux bien essayer avec du macrogol (disponible en pharma en prenant une tête de circonstance)
si le macrogol 4000 correspond au PEG 4000, on aurait une température de fusion de 54°

[golgi]

Bonjour Frédéric,
Quelques problèmes de santé et le temps de me familiariser avec php, j'arrive, enfin j'essaye ! Si j'ai bien compris ton problème est la coupe d'insecte, c'est à dire, commun chez les Invertébrés, la présence de chitine à la surface du corps et parfois à l'intérieur. Tout le problème est là ; cette s... de molécule, solide et peu perméable rend la coupe difficile et aléatoire. Je n'ai pas d'expérience PEG, seulement celles de la paraffine ou des résines epoxy. En premier lieu, t'intéresser à une libellule "morte" me semble un investissement temps/matériel peu utile. L'altération cadavérique ( autodestruction des cellules ) donnera vraisemblablement une pauvre image des tissus. Principe : toujours fixer du matériel vivant, un peu barbare mais bon.. ! Je crois que tu ne peux éviter d'utiliser la méthode paraffine, impliquant une fixation suivie d'une déshydratation rigoureuse ( alcool éthylique par ex. ), imprégnation d'un solvant paraffine ( voir note plus bas ) et bains progressifs puis définitifs dans la paraffine liquide, à chaud env. 60 C . La coupe est difficile et demande pas mal de soins et persévérance, vertus inhérantes à l'histologiste !
Techniquement cela implique que tu puisses disposer d'une étuve ( paraffine ) et d'un microtome type Minot et lames solides. Accessoirement, une platine chauffante pour étaler et coller les coupes obtenues.
Concernant les solvants, trichlo et xylol / benzène sont +/- interdits et difficiles à se procurer. Avantageusement remplacés par de nouveaux produits tels que Histoclear de National Diagnostics, solvant d'origine ...végétale, à l'odeur de citron ou d'orange ! Je l'ai trouvé chez Chemie Brunschwig, à Bâle dont le lien mentionne 2 représentants en France :
BLD APELEX
Z.I de Malines, 22 bis rue des Malines
CE 2703-USSES,
91027 EVRY CEDEX
Phone: 01 69 91 05 24
apelex@apelex.fr
http://www.apelex.com
VWR International SAS
201 rue Carnot
F-94126
Fontenay-sous-bois,
CEDEX
Phone: 33825023030
service.clients@fr.vwr.com

Bon, voilà pour le moment, dis moi je te prie si tu disposes du matériel requis et le cas échéant on causera technique.
Cordialement,
Guy

[Maraussan]

Bonjour,
Histo-Solve et Histo-Clear sont des noms commerciaux, correspondant aux Roti-Clear ou Roti-Histol de Carl Roth France. C'est la même molécule active, le limonène, extrait de l'écorce des Citrus. Sans être cancérigène comme le xylène ou le toluène, attention, on peut y être intolérant. Il est donc nécessaire de bien ventiler le labo...

Quant à l'alcool éthylique pur destiné à deshydrater avant inclusion, il est bien plus aisé de travailler actuellement avec du tert-butanol (alcool tert-butylique, triméthylcarbinol2-méthylpropan-2-ol...). Ne pas utiliser l'alcool isopropylique.

Valable en histologie animale ET végétale...

[Fredlab]

Hello

Merci pour ton message.
Je remise mon idée à plus tard.

Techniquement cela implique que tu puisses disposer d'une étuve ( paraffine ) et d'un microtome type Minot et lames solides. Accessoirement, une platine chauffante pour étaler et coller les coupes obtenues.

J'ai ces choses (pour la solidité des lames de microtome, je ne saurais dire - j'ai deux lames plus ou moins bien aiguisées et j'ai un porte-lames jetables et des lames Acu-Edge 4689) - pour la platine chauffante, j'ai un machin (pas encore testé) qui permet de récupérer les coupes dans un bain chaud...

Sinon, pour les produits, je n'ai rien de plus que ce que j'ai annoncé plus haut.
J'hésite vraiment à passer à la paraffine et à l'achat de tous les produits qui vont avec.
J'ai trop peur de manquer de temps, de rigueur et de moyens pour arriver à quelque chose de potable.
(par exemple, mon "labo" actuel est dans mon bureau... manque de place pour étaler tout le matos, pas de paillasse imperméable, pas de point d'eau...)

On verra plus tard.
Je saurais me souvenir de ce topic.

[golgi]

OK Frédéric, à disposition si utile / nécessaire. Merci à Maraussan pour les précisions !
Guy